La sclerosi multipla (SM) è una patologia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiammazione cronica, demielinizzazione e gliosi. Rappresenta il più comune processo infiammatorio demielinizzante del SNC e si presenta con aree multifocali di demielinizzazione con conservazione relativa degli assoni, perdita di oligodendrociti e cicatrizzazione astrogliale. La lesione acuta della SM, invece, è caratterizzata da un manicotto perivenulare, da infiltrazione tessutale di cellule mononucleate, soprattutto linfociti T e macrofagi, e da demielinizzazione. Tutti questi elementi morfologici sono espressione dell’origine immunomediata della malattia .
Le anomalie liquorali comprendono una pleiocitosi cellulare mononucleare, peraltro poco specifica di SM, e soprattutto un aumento delle concentrazioni di IgG e la presenza di bande oligoclonali di IgG di sintesi intratecale. Nell’80% circa dei pazienti la concentrazione di IgG nel liquor è aumentata in presenza di una concentrazione totale di proteine ancora nella norma, come conseguenza della sintesi intratecale di IgG da parte dei B-linfociti del SNC in stato di attivazione.
La tecnica più sensibile per la determinazione qualitativa della bande IgG oligoclonali è l’isoelettrofocalizzazione (IEF), che viene preferenzialmente utilizzata per fare diagnosi di SM: le bande oligoclonali rappresentano infatti l’indice più sensibile di sintesi intratecale di IgG. I gel su cui si fanno correre i campioni di siero e liquor possono essere di agaroso o poliacrilammide, “home-made” o commerciali (disponibili in diversi formati). I campioni di siero e liquor vengono fatti correre appaiati. La quantità di IgG presenti nel siero e nel liquor caricati deve essere la stessa. I gel per l’isoelettrofocalizzazione contengono anfoliti (composti anfoteri) che creano un gradiente di pH: in questo modo le IgG si separano all’interno del campo elettrico in base al loro punto isoelettrico e non in base al peso molecolare. Dopo la corsa le proteine vengono trasferite a secco su un foglio di nitrocellulosa, che successivamente viene incubato con BSA per la saturazione, con un anticorpo primario anti-human IgG, quindi con un anticorpo secondario coniugato con HRP (è possibile inserire un ulteriore passaggio di amplificazione del segnale con un secondario biotinilato e successiva incubazione con streptavidina-HRP). Infine lo sviluppo avviene per via colorimetrica.
Da sempre il kit per Isoelettrofocalizzazione con metodo di immunoblotting e colorazione con perossidasi di Helena Biosciences Europe COMBI SAS IgG-IEF a singolo e/o doppio anticorpo risulta essere il metodo di eccellenza nella diagnosi di Sclerosi Multipla.
Presso il Laboratorio Ospedaliero Universitario del Policlinico Riuniti di Foggia sono installate le apparecchiature Helena commercializzate da Medical Systems ed in particolare il sistema SAS3-SAS4 in gel d’agarosio e la strumentazione V8 in tecnica capillare. Con quest’ultimo analizzatore e l’utilizzo del tampone SPE Buffer, il dottor Michele Falcone Responsabile del Settore Proteine, in via sperimentale, esegue l’elettroforesi delle proteine CFS, in circa 10 minuti , si ottiene un tracciato che è di grande utilità clinica nello studio del liquor ed affianca gli esami di routine per la diagnosi di SM quali Protidorachia, Glucoracchia, conteggio cellulare ed Isoelettrofocusing IEF.
Si ringrazia il dottor Falcone, sulla disponibilità di pubblicazione sia di una parte di articolo “L’analisi delle proteine liquorali con un nuovo sistema di Elettroforesi capillare” che della relativa pubblicazione.
Le proteine del liquor
Le proteine del liquor sono indagate con differenti metodi, il loro studio è associato alla diagnosi e alla cura di differenti malattie neurologiche. Alcune proteine del siero sono sostituite nel liquor da altre. L’alfa 2 macroglobulina nel siero è sostituita nel liquor dalla beta-trace, il fibrinogeno dalla gamma-trace e la beta- lipoproteina dalla transtiretina (pre-albumina). Ecco un breve elenco delle principali proteine di liquor ricercate per differenti malattie neurologiche:
Albumina: proteina più abbondante, utile per lo studio della barrieraemato-encefalica
Transtiretina (prealbumina): pI molto acido non passa dal sangue al liquor, l’alta concentrazione liquorale è dovuta alla sintesi dai plessi corioidei
Beta-trace: prostaglandina-D-sintetasi, proteina di trasporto per ligandi lipofilici, seconda proteina più abbondante.
Gamma-trace: identificata come Cistatina C, inibisce le proteasi, coinvolta nell’emorragia cerebrale ereditaria con amiloidosi
Beta2-microglobulina, ha una concentrazione quasi identica a quella sierica
Lisozima, è prodotto dai polimorfonucleati, funzione anti-batterica, con concentrazioni simili a quelle sieriche, nelle meningoencefaliti batteriche si ha sintesi intratecale
Lattoferrina, proteina cationica eosinofila anti-batterica
Beta-transferrina, più abbondante, deriva dalla Trf che perde una molecola di ac. sialico per opera della neuraminidasi (asialo-Trf). Sono presenti due isoforme: b1 e b2 Trf, che hanno differente mobilità elettroforetica, la b2 Trf è assente nel siero, è utilizzata per differenziare il liquor da altri liquidi biologici (oto/rinorrea)
Proteina Tau, P-Tau, B-Amiloide: studio del Morbo di Alzheimer
L’elettroforesi del Liquor
Si è da tempo esaminato il liquor con i metodi elettroforetici, previa concentrazione del liquor. Ma la concentrazione ha differenti controindicazioni che ne scoraggiano l’utilizzo. Con questa nuova tecnologia in tecnica capillare ed in particolare con la strumentazione V8 , l’elettroforesi del liquor si può attuare su campione senza alcuna manipolazione.
Su testi di Patologia clinica sono riportati studi di elettroforesi del liquor e sono proposti pattern proteici tipici: un quadro di aumentata quantità di proteine plasmatiche, favorevole passaggio dal plasma al liquor per aumentata permeabilità della barriera ematoencefalica, come nelle malattie infiammatorie acute del SNC e o delle meningi, meningite batterica e o virale, malattie infiammatorie croniche, meningoencefalite cronica, tumori maligni, malattie vascolari cerebrali. Sono riportati quadri di variazione delle proteine plasmatiche: il caso tipico del Mieloma riflesso nel liquor, fase acuta della meningite batterica con rilevante aumento della zona alfa 2 e simile aumento nel siero. Infine è riportato un quadro, detto gamma globulinico, con aumento delle zona gamma e presenza di oligoclonalità. Quest’ultimo caso è studiato in modo appropriato con l’Isoelettrofocusing per la Sclerosi Multipla in special modo. Da questi dati emerge come l’applicazione dell’elettroforesi proteica del liquor è un esame da applicare. La nuova tecnologia in capillare non fa che rendere più agevole e fruibile questo test. Su l’analizzatore V8, per eseguire l’elettroforesi del liquor è necessario indicare un metodo con una maggiore sensibilità rispetto al siero.
Con la strumentazione in tecnica capillare V8 , utilizzando il tampone SPE Buffer , i campioni di liquor hanno tracciati tipici e si osservano le seguenti bande : prealbumina – Albumina – Alfa 1 – Alfa 2 – Beta – Gamma. Numerose tracce presentano anche due bande affiancate in Beta che corrispondono alla Transferrina e la Asialo Transferrina
Lo scopo di questo lavoro è osservare, se possibile, come si dispongono le diverse importati proteine del liquor all’elettroforesi in capillare.
Molto importante è l’analisi morfologica della zona Gamma delineata quasi esclusivamente dalla IgG. Infatti c’è una correlazione diretta tra dosaggio immuno-nefelometrico delle IgG Liquorali e il valore espresso delle gamma da frazione delle proteine totali liquorali. Ma l’aspetto più importante ed interessante è che una curva piuttosto piatta e senza alcun cenno di addensamento correla con IEF assenza di bande oligoclonali. Al contrario una curva anche lievemente rilevata e ancor più con asimmetria ed addensamento correla con IEF positivo, cioè presenza di bande oligoclonali liquorali. L’elettroforesi aiuta l’operatore a meglio osservare l’IEF e la correlazione tra Elettroforesi e IEF raggiunge il 99%. Da rilevare che l’elettroforesi delinea la Componente Monoclonale con picco ben separato, mentre l’IEF lo espone con numerose bande oligoclonali. Presso il Policlinico Riuniti di Foggia, data l’organizzazione del lavoro, si realizza che il clinico nello stesso giorno in cui invia un Liquor per IEF, riceve nella stessa giornata il calcolo degli indici liquorali e l’elettroforesi, ciò è di rilevante aiuto, egli potrà già formulare una ipotesi diagnostica anche senza il risultato dell’IEF. Quest’ultimo sarà eseguito dopo aver raggruppato almeno 3 o 4 liquor da esaminare per l’accurato utilizzo dei kit.
Si evidenziano due esempi di elettroforesi di liquor affiancata con l’esecuzione dell’Isoelettrofocusing in gel di agarosio al fine di confrontare i risultati ottenuti dalla struementazione V8.
Esempio di Isoefocusing negativo
Paramentri del Paziente
Elettroforesi del Liquor : normale
Isoelettrofocusing : Immunoblotting liquor : Assenza di bande oligoclonali
Immunblotting siero : Assenza di Bande Oligoclonali
Descrizione Tracciato : Tipo 1
Proteine Liquor 48,40 mg/dl – Albumina Liquor 28,10 mg/dl – IgG Liquor 2,93 mg/dl
Q-Albunina 6.33 – Q-IgG 2,85 – Indice di Link 0.45 – IgM Liquor <0.694 mg/dl – Qlim 4.265 – IgGLoc -1.46 – R Gluc Liq/Siero 0.64
Esempio di Isoefocusing positivo
Elettroforesi del Liquor :Addensamento in Gamma
Isoelettrofocusing : Immunoblotting liquor : Presenza di 9 bande oligoclonali
Immunblotting siero : Assenza di Bande Oligoclonali
Descrizione Tracciato : Tipo 2
Proteine Liquor 36.90 mg/dl – Albumina Liquor 17.43 mg/dl – IgG Liquor 6.99 mg/dl
Q-Albunina 4.17 – Q-IgG 9.47– Indice di Link 2.27 – IgM Liquor <0.694 mg/dl – Qlim 2.809 – IgGLoc -4.92 – R Gluc Liq/Siero 0.68
Link alla pubblicazione: Pubblicazione V8 Liquor